Apresentação
Cálculo da Tm
Introdução à PCR
Conceitos Básicos
Reação de PCR
Projeto de Primers
Conceitos de Termodinâmica
Fórmulas para o Cálculo da Tm
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Introdução

Muitas técnicas utilizadas na análise de moléculas de DNA requerem que a sequência esteja disponível em grandes quantidades para viabilizar a realização de diversos experimentos. A possibilidade de se criar inúmeras cópias de uma molécula de DNA em laboratório otimiza este trabalho, uma vez que a molécula em questão não precisa ser extraída diretamente do organismo ao qual pertence.

O processo de produção em laboratório (in vitro) de cópia de uma molécula de DNA é possível através de reações de PCR (Polymerase Chain Reaction). Uma das principais aplicações da PCR é na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo, gotas de sangue ou saliva ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) são amplificadas (replicadas) para serem analisadas. A PCR também é rotineiramente utilizada em procedimentos científicos de Biologia Molecular tais como amplificação e identificação de patógenos (por exemplo, vírus) presentes nas amostras ou ainda preparação de fragmentos de DNA para clonagem.

Na reação de PCR, em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou do material a ser estudado. Depois de extraído, o DNA é submetido a uma mistura que contém os componentes necessários para que a duplicação ocorra. Um dos principais componentes é o primer, sequência iniciadora do processo de síntese e corresponde a uma curta cadeia de nucleotídeo complementar ao início da sequência alvo (sequência de DNA que se deseja ampliar).

A PCR corresponde a execução de uma série de reações que ocorrem em diferentes temperaturas pré-estabelecidas com tempos exatos e específicos para cada fragmento de DNA a ser amplificado. Cada ciclo é dividido em etapas bem definidas. Na primeira etapa a temperatura é elevada para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (desnaturação). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida para que os primers se pareiem com a fita molde de DNA (pareamento). Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada para que uma enzima sintetizadora (enzima polimerase) atue na extensão do primer e assim dar origem a uma da nova molécula (extensão). Essas três etapas são executadas ciclicamente por um número definido de vezes.

Diversos parâmetros tais como, o número de ciclos, a temperatura e o tempo de duração de cada etapa, bem como a qualidade e a quantidade de primers utilizados podem interferir na reação de PCR.

Para cada uma das etapas de uma reação, (desnaturação, pareamento e extensão) existe uma temperatura ideal, na qual a performance da reação é máxima. Define-se temperatura de melting Tm ou temperatura de pareamento, como a temperatura na qual metade das moléculas estão pareadas e a outra metade não. São encontradas na literatura diferentes formulações para o cálculo da Tm, todas elas sendo apenas uma aproximação da temperatura de melting real de um primer.

Como já exemplificado, diversas são as técnicas/procedimentos de Biologia Molecular que se baseiam na reação de PCR (clonagem, amplificação, mutagênese, etc) e, consequêntemente envolvem o projeto de primers bem como o cálculo da temperatura de melting.

Este trabalho tem por objetivo geral o estudo e implementação dos diferentes métodos de cálculo da Tm a fim de avaliar quão divergentes são os resultados produzidos pelas mesmas.